Prácticas de Laboratorio

“RECUENTO DIRECTO DE PLAQUETAS “

1.    INTRODUCCIÓN.

El recuento de plaquetas puede hacerse  de manera directa y de manera indirecta. El método directo, a su vez, requiere  de un contador electrónico que sea capaz de hacer el recuento de las diferentes células sanguíneas ( leucocitos, eritrocitos y plaquetas), ó en su defecto,  podrá hacerse mediante el método manual, en el que se empleará la cámara de Neubauer y la pipeta de Thoma. El método indirecto es muy útil cuando se tiene dudas sobre los resultados emitidos por cualquiera de los métodos directos, y/ó como modo de confirmar  éstos.Esto sucede por ejemplo, cuando la muestra no fue adecuadamente anticoagulada a la hora de ser tomada, ó cuando se tienen cifras anormalmente altas ó anormalmente bajas,

2.    PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

En el recuento directo de las plaquetas mediante la cámara de Neubauer, se mezcla la sangre  en la pipeta de Thoma con un diluyente  que cause la hemólisis de los eritrocitos. Se llena el hemocitómetro con dicha mezcla y se recuentan las plaquetas en la cuadrícula central, de preferencia con microscopio de contraste de fases y con el objetivo de 40X.

3.    LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos

NUMERO	NOMBRE DEL REACTIVO	CONCENTRACIÓN	CANTIDAD
1	Oxalato de amonio	1%	1 ml

           3.2 Equipo de Laboratorio

1.1.1     Centrífuga

1.1.2     Agitador eléctrico

1.1.3     Microscopio de luz

3.3 Materiales de Laboratorio       

NÚMERO	DESCRIPCIÓN
2	Tubos de recogida de muestras con EDTA
1	Aguja  de Vacutainer
1	Contenedor de Vacutainer
1	Jeringa
1	Torundas de algodón con  alcohol isopropílico
1	Ligadura
1	Cámara de Neubauer
1	Pipeta de Thoma
1	Boquilla y  manguera para aspiración

4.PROCEDIMIENTO.

4.1 Técnica

  4.1.1  Si se obtiene la muestra por punción digital, el sitio debe estar limpio y la sangre debe fluir libremente. Limpia la primera gota. Si la muestra es de sangre venosa debe obtenerse con una jeringa de plástico seca ( ó de vidrio siliconizado ) con aguja corta, de calibre no menor  al 21.Retirar la aguja antes de poner la sangre en un tubo de plástico con EDTA. La sangre y el anticoagulante deben mezclarse  inmediata y cuidadosamente, para evitar la formación de espuma.

4.1.2     El mezclado de la sangre con anticoagulante debe realizarse suavemente y durante unos cinco minutos.

4.1.3     Con la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca de 1.0 y se diluye hasta la marca de 101 con el oxalato de amonio ( dil.1:100).Hacer por duplicado.

4.1.4     Colocar las pipetas  en el agitador  de 10 a 15 minutos.

4.1.5     Llenar la cámara de Neubauer con el contenido de las pipetas debidamente mezclado, desechando las primeras 4-6 gotas.

4.1.6     Cubrir la cámara  con una caja de Petri de 10 a 20 min, para permitir que las plaquetas se sedimenten. Colocar un pedazo de algodón ó de papel filtro mojados dentro de la caja para evitar la evaporación.

4.1.7     Empleando el microscopio de contraste de fases, contar las plaquetas en la cuadrícula central destinada a la cuenta de glóbulos rojos ( 25 cuadros  centrales )calculando la cifra de plaquetas como sigue:

              

No. De plaquetas /μl= No de plaquetas contadas X factor de dilución( 100)  X factor de corrección de volumen ( 10)= No de plaquetas contadas X 1000.

4.1     Factores de Error en las Cuentas Celulares.

          4.2.1  Cuando se use sangre capilar se requiera una gota que fluya                  libremente.

4.1.2      Las muestras de sangre anticoagulada se deben mezclar  cuidadosamente invirtiendo el tubo de sangre por lo menos 20 veces. No se debe agitar el tubo pues se forma espuma que impide medir cantidades exactas. Inclinar el tubo bien mezclado a un ángulo de 45°, ó ligeramente mayor, y pipetear del borde superior del tubo siguiendo las mismas indicaciones que para sangre capilar.

4.1.3       Las pipetas deben estar limpias y secas.

4.1.4     Tomar las muestras  con la pipeta en forma rápida y precisa. Si se rebasa la línea del volumen deseado ligeramente, ajustar tocando un papel absorbente con la punta de la pipeta,

4.1.5     Limpiar  el exterior de la pipeta antes de introducirla  en la solución disolvente.

4.1.6     La cámara se llena por acción capilar, regulando  el flujo del líquido de la pipeta,  para que fluya suave y rápidamente, Llenar  la cámara completamente, sin permitir que el líquido rebase los límites. Esperar de 10 a 20 minutos a que las células se asienten en el área de conteo. Proseguir con el conteo.

4.1.7     La cámara del hemocitómetro y el cubreobjetos deben estar limpios y secos  antes de usarse. Esto evita errores graves que se producen  por las huellas digitales y las superficies aceitosas.

ACTIVIDADES.

1.    Reportar resultados.

“TIEMPO DE COAGULACIÓN “

1.    INTRODUCCIÓN.

El tiempo de coagulación es un estudio creado en 1939. Nos da un indicio aproximado de la eficacia global del mecanismo intrínseco de la coagulación.

La prueba carece de valor para las insuficiencias ligeras de distintos factores, porque basta con una pequeña cantidad de trombina para producir  un coágulo fibrina. Todavía es menos útil para las anomalías de las últimas etapas de la coagulación.

2.    PRINCIPIO Y METODOLOGÍA          

El tiempo  de coagulación mide el intervalo de tiempo necesario para que una muestra de sangre completa  recién obtenida coagule in vitro a 37°C y evalúe  en forma general el mecanismo de coagulación intrínseco.

Dos son las finalidades más relevantes de este método:

1.    Evaluar la función del sistema intrínseco de la coagulación sanguínea.

2.    Vigilar la eficiencia de la administración de heparina.

3     .LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1Equipo de laboratorio.

3.1.1Baño María a 37°C

3.1.2Cronómetro

3.2Material  de Laboratorio.

CANTIDAD	DESCRIPCIÓN
3	Tubos de vidrio de 12X75
1	gradilla

4. PROCEDIMIENTO.

4.1 Método de Lee-White

1.    Se   extrae sangre venosa con una jeringa de 5 ml, y una aguja gruesa ( del No.18 ó 19 ). La punción venosa debe ser perfecta, pues la contaminación con linfa puede modificar los resultados.

2.     Preparar el baño María a 37°C, colocando una gradilla dentro de él, con 3 tubos de 12 X 75.

3.    Se le realiza al paciente una punción de 3 ml poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que entra la sangre a la jeringa.

4.    Terminada la punción, se deposita 1ml de sangre en cada tuboy se vigilan cada 30 seg., inclinándolos suavemente y anotando el tiempo en que coagula cada uno de ellos.

5.    Se suman los tres tiempos, y se calcula el promedio, obteniendo así el resultado.

6.    Durante el proceso, evitar la agitación, que podría retardar el tiempo de coagulación.

4.2 Valores de Referencia: 4-10 minutos.

"TIEMPO DE SANGRADO"

1.INTRODUCCIÓN.

El tiempo de sangrado es una medida de Integridad vascular y plaquetaria. Las plaquetas se adhieren a la colágena expuesta ( subendotelial) y después entre ellas, para formar un agregado que obtura la herida. Para la agregación plaquetaria, también es necesario un factor del plasma: el factor de Von Willebrand.

2.PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El tiempo de sangrado se mide determinando el tiempo necesario para que dejen de sangrar los pequeños vasos subcutáneos que han sido lesionados por una Incisión estandarizada. Uno de los mayores problemas que confronta la medición del tiempo de sangrado es la reproducibilidad. Por esta razón se han desarrollado tres generaciones de pruebas, cada una con aumento en la estandarización de la herida en profundidad y longitud.

El método más antiguo es el de Duke, que consiste en hacer una punción del lóbulo de la oreja con una lanceta estéril. La desventaja de este método es que es muy difícil estandarizar la profundidad de la incisión. Además, si el paciente tiene un serio problema hemorrágico, el sangrado en el tejido celular blando del lóbulo de la oreja puede causar un hematoma grande.

El método de Ivy está mejor estandarizado que el de Duke. Se utiliza una lanceta ó estilete para producir una incisión en la cara anterior del antebrazo. La navaja tiene un tope que "mita la profundidad de la Incisión. Además, como la cara anterior del antebrazo es suficientemente larga para permitir varias incisiones, pueden hacerse dos ó tres de ellas y promediar sus resultados. Adicionalmente, en este método está mejor estandarizada la presión del sistema vascular, ya que un esfingomanómetro que se coloca en el brazo (40 mmHg), mantiene la presión venosa dentro de límites reducidos.

3.LISTA DE REQUERIMIENTOS

       3.1Material de Laboratorio

CANTIDAD	DESCRIPCIÓN
1	Lancetas desechables estériles
1	Tiras de papel filtro
1	Torundas de algodón con alcohol

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Técnica: Método de Duke.

1.   Limpiar perfectamente el lóbulo de la oreja o la yema de un dedo con una torunda con alcohol. Dejar secar .

2.   Puncionar el sitio elegido con la lanceta, echando a andar al mismo tiempo, el cronómetro. La punción debe hacerse en un solo movimiento, introduciendo la lanceta hasta el fondo y sin hacer movimientos laterales de ésta para no rasgar la piel o hacer más amplia la punción.

3.   Sin tocar la piel, con una t'ra de papel filtro, secar la gota de sangre que salga por el sitio de pund6n cada 30 segundos, hasta que ea papel flltro ya no absorba sangre.

4.   Anotar el tiempo en que deje de sangrar .

Ventajas: es muy sencillo de realizar .

Desventajas: Las condiciones de la prueba no son constantes, por lo tanto los resultados son imprecisos.

4.3 Valores de Referencia.

Método de Duke: 1 a 4 minutos

Método de Ivy: de 2 a 6 minutos

"MEDICIÓN DEL SISTEMA EXTRÍNSECO

TIEMPO DE PROTROMBINA ( TP ) EN UNA ETAPA"

1.    INTRODUCCIÓN.

El análisis de tiempo de Protrombina es sensible a las deficiencias del sistema extrínseco de la coagulación ( factores I, II, V, VII ó X ). El TP se utiliza como exploraci6n prequirúrgica para detectar posibles problemas hemorrágicos. Un TP prolongado Generalmente es indicativo de un nivel bajo en uno o más de los factores del sistema de coagulación extrínseco ó común, cuya causa pueden ser trastornos hereditarios de la coagulación, una deficiencia de vitamina K, problemas hepáticos ó ingestión de fármacos. El TP es el análisis de laboratorio más corriente empleado para monitorizar la terapia anticoagulante oral, puesto que es sensible a los factores VII y X.

No es sensible a las deficiencias del sistema intrínseco ( factores VIII. IX. XI y XII ) ó a las disfunciones plaquetarias. No puede utilizarse para la monitorización de la terapia de heparina, para la cual está recomendada la determinación del Tiempo de activación Parcial de Tromboplastina ( ATTP)

2.    PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El TP es el tiempo requerido para que se coagule el plasma después de agregarle tromboplastina tisular v una cantidad óptima de cloruro de calcio,  reponiendo el calcio  que fue inactivado con el anticoagulante y agregando una tromboplastina completa para activar la vía extrínseca. El método de referencia de la Prueba del TP en una etapa es el recomendado por el Consejo Internacional de Estandarización en Hematología/Consejo Internacional de Trombosis y Hemostasia (CIEH/CITH).

Los resultados obtenidos dependen de numerosos factores como la temperatura, la calidad del agua, el pH, la fuerza iónica, el método de ensayo utilizado, la recogida y conservación de las muestras, y la población de pacientes en consideración. Los rangos normales de muestras deben ser establecidos para cada laboratorio.

  Para cada nuevo lote de tromboplastina ( preparada en el laboratorio ó comercial ), se deben establecer valores normales en muestras de plasma, de aproximadamente 20 hombres ó mujeres que no estén tomando anticonceptivos. Para ello, no es necesario que todas las pruebas se efectúen el mismo día. Es preferible hacerlas en días distintos pues así se consigue agregar la variabilidad de día a día. La media y la desviación estándar se calculan a partir de los resultados.

El resultado de la prueba en segundos se convierte a Porcentaje de Actividad normal por medio de una curva de referencia.

El Índice de tiempo de Protrombina se calcula dividiendo el TP por el TP medio Del rango normal del laboratorio, representado por una muestra testigo normal.

  Para emplearse en el control de la medicación anticoagulante, el Índice de Protrombina debe designarse en los informes de laboratorio de manera estándar como Tasa Normalizada Internacional de Protrombina ó INR del inglés International Normalizad Ratio. 

SE SUGIERE PUES, REPORTAR DE LA SIGUIENTE MANERA:

TIEMPO DE PROTROMBINA:

Testigo del dia ……………………………………..X segundos

Plasma Problema …………………………….... …X segundos

Porcentaje de actividad ……………………… ……….%

INR  ………………………………………………………X

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1  Reactivos

NUM	NOMBRE DEL REACTIVO	CONC	CANTIDAD
1	Reactivo de Tromboplastina.*		200μl
2	Diluyente**		10 ml
3	Anticoagulante Citrato de sodio	3.2 a3.8%	1gota/ml de sangre

*Reactivo de Tromboplastina: Tromboplastina tisular procedente de cerebro de

  conejo, iones de Caldo V estabilizador .

**Diluyente. Estabilizadores y Conservantes. Contiene azida sódica al 0.05% como conservante.

3.2  Equipo de Laboratorio

-    Baño María con termostato a 37º C

-    Cronometro.

           3.3 Material de Laboratorio

CANTIDAD	DESCRIPCIÓN
1	Micropipeta con punta desechable
1	Tubos de recogida al vacío  con   citrato de sodio al 3.2% ó 3.8%.
1	Gradilla.
3	Tubos de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla.
1	Gancho de alambre  metálico,

4.PROCEDIMIENTO

4.1Técnica:

4.1.1  Calentar previamente un volumen suficiente del reactivo de tromboplastina reconstituido a 37ºC .Tomar las precauciones necesarias para Impedir la evaporación y no mantener a 37ºC sin tapón durante más de 60 minutos antes del uso.

4.1.2. Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra ( paciente y control) del análisis.

4.1.3.  Agregar 0.1 ml de muestra al tubo apropiado.

4.1.4   Incubar cada muestra y control a 37ºC de 3 a 10 min.

4.1.5   Con fuerza, agregar 0.2 ml del reactivo de tromboplastina precalentado, y al mismo tiempo, iniciar el cronometraje de detección de coagulación. 

4.1.6   Anotar el tiempo en segundos requerido para detectar la coagulación.

4.2 Preparación de la Muestra  y del Reactivo.

4.2.1Muestra: No es necesario que el paciente esté en ayunas ni se someta a otra preparación especial. Se recomienda plasma con anticoagulante de citrato de sodio al 3.2% en una proporción de nueve partes de sangre por una de anticoagulante.

4.2.2 Reactivo: El reactivo se prepara de la siguiente manera:

Reconstituir un vial de reactivo de tromboplastina con un vial de diluyente. Los dos componentes deben ser del mismo lote del kit. Volver a tapar el vial e invertirlo suavemente varias veces para garantizar una rehidratación completa. Dejar reposar durante 30 min. A temperatura ambiente. Invertir suavemente antes de su uso para garantizar homogeneidad .El reactivo permanece estable durante cuatro días si se mantiene en el vial original, tapado herméticamente y se almacena a 2-8ºC, y registrar la fecha de la reconstitución en la etiqueta del vial.

"MEDICIÓN DEL SISTEMA INTRÍNSECO

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA ( TTPa )"

1.    INTRODUCCIÓN

Esta prueba mide la actividad procoagulante intrínseca del plasma. Esta prueba es sensible a todos los factores que intervienen en el sistema intrínseco, y no mide la actividad de los factores VIl y XIII.

2.    PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.

   2.1  Principio.

La tromboplastina parcial es un sustituto del factor plaquetario 3 ( fosfolípidos de cerebro de conejo). La activación por contacto se estandariza añadiendo un activador como caolín, celita ó ácido elágico al reactivo.

1.2  Metodología: Preparación de las Muestras.

En un tubo limpio, conteniendo una parte de sol. Anticoagulante , añadir 9 partes de sangre recién obtenida. Mezclar con suavidad. Conservar el tubo en refrigerador ó en hielo picado. Antes de realizar la prueba, centrifugar y separar el plasma. Las pruebas deben complementarse dentro de las 4 horas siguientes a la obtención de la muestra.

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1  Reactivos

NUM	NOMBRE DEL REACTIVO	CONC	CANTIDAD
1	Reactivo de Tromboplastina Parcial*		200μl
2	Cloruro de calcio	0.025 M	10 ml

*Fosfolípidos de cerebro de conejo adicionado de partículas de sílice micronizada que actúan como activador ( superficie de contacto) y tampón ácido.

3.2  Equipo de Laboratorio

-    Baño María con termostato a 37º C

-    Cronometro.

           3.3 Material de Laboratorio

CANTIDAD	DESCRIPCIÓN
1	Micropipeta con punta desechable
1	Tubos de recogida al vacío  con   citrato de sodio al 3.2% ó 3.8%.
1	Gradilla.
3	Tubos de ensayo de 12 X 75
1	Gancho de alambre  metálico,

2.    PROCEDIMIENTO

3.1TÉCNICA. ( método manual) .

3.1.1.  Calentar previamente a 37°C un volumen suficiente de solución de cloruro de Calcio 0.025M.

3.1.2.  Identificar un tubo de ensayo para cada muestra a analizar ( pacientes y controles). Se aconseja hacer las pruebas por duplicado.

3.1.3   Dispensar 0.1 ml de plasma a su tubo correspondiente. Añadir 0.1 ml del reactivo de tromboplastina parcial a cada tubo.

3.1.4.  Incubar a 37°C durante 5 minutos exactos ( tiempo de activación).

3.1.5.  Inmediatamente añadir 0.1 ml de solución de Ca 0.025M. Simultáneamente poner el cronómetro en marcha y determinar la formación del coágulo.

3.1.6.  Anotar el tiempo en segundos, transcurridos hasta la formación del coágulo.

“RETRACCION DEL COÁGULO “

1.    INTRODUCCIÓN.

La observación del coágulo formado en un tubo de ensayo proporciona información sobre:

a)La concentración del fibrinógeno,b) el número y función de las plaquetas y c) la actividad del sistema fibrinolítico.

2.    PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.

2.1     Aproximadamente el 30% del volumen total de sangre en el tubo debe coagularse

2.2       En casos de trombocitopenia ó de disfunción  plaquetaria muy anormal, como en la trombastenia, se forma un coágulo grande de estructura débil. Asimismo, en casos de paraproteinemia ( mieloma ó macroglobulinemia de Waldenstrom), la retracción del coágulo puede estar muy trastornada.

2.3      Un coágulo pequeño de forma regular ocurre cuando la concentración del     fibrinógeno es baja.

2.4        Un coágulo pequeño de forma irregular se observa cuando el incremento en la actividad fibrinolítica lo digiere, como ocurre en la coagulación intravascular diseminada ( CID ).

2.5        No se observa formación de coágulo alguno.

2.6    Causas de error

       Tubos de ensayo sucios

                          Contaminación de sangre con anticoagulante

1.    LISTA DE REQUERIMIENTOS.

        3.1Equipo de Laboratorio.

Baño María a 37°C

         3.2Material de Laboratorio

CANTIDAD	DESCRIPCIÓN
2	Tubos de vidrio de 13 X 100 de fondo redondo
1	Gancho de alambre
1	Aplicador de madera
1	Caja Petri con papel filtro dentro de ella
1	Jeringa de 5 ml ó Sistema Vacutainer
1	Ligadura
1	Torunda con alcohol isopropílico

2. PROCEDIMIENTO

1.1     Tomar una muestra de sangre y depositar la muestra en un tubo de vidrio de 13 X 100

1.2     Colocar  el tubo con la muestra de sangre en el baño María a 37°C durante 3 horas.

1.3     Observar después de transcurrido este tiempo, la forma del coágulo, rodeado de suero

1.4     .Ayudarse con el gancho de alambre  para vaciar el contenido del tubo lentamente a la caja de Petri con un papel filtro dentro de ella.

1.5     Observar y buscar un coágulo pequeño en caso de que en el tubo no se haya apreciado un  coágulo grande.

Bibliografía:

DESCHAMPS LAGO MARIA ESTHER. Manual de Practicas de Laboratorio. Veracruz, México. 46 páginas.