“RECUENTO
DIRECTO DE PLAQUETAS “
1.
INTRODUCCIÓN.
El recuento de plaquetas puede
hacerse de manera directa y de manera
indirecta. El método directo, a su vez, requiere de un contador electrónico que sea capaz de
hacer el recuento de las diferentes células sanguíneas ( leucocitos,
eritrocitos y plaquetas), ó en su defecto,
podrá hacerse mediante el método manual, en el que se empleará la cámara
de Neubauer y la pipeta de Thoma. El método indirecto es muy útil cuando se
tiene dudas sobre los resultados emitidos por cualquiera de los métodos
directos, y/ó como modo de confirmar
éstos.Esto sucede por ejemplo, cuando la muestra no fue adecuadamente
anticoagulada a la hora de ser tomada, ó cuando se tienen cifras anormalmente
altas ó anormalmente bajas,
2.
PRINCIPIO Y METODOLOGÍA
En el recuento directo de las
plaquetas mediante la cámara de Neubauer, se mezcla la sangre en la pipeta de Thoma con un diluyente que cause la hemólisis de los eritrocitos. Se
llena el hemocitómetro con dicha mezcla y se recuentan las plaquetas en la
cuadrícula central, de preferencia con microscopio de contraste de fases y con
el objetivo de 40X.
3.
LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1
Reactivos
NUMERO
|
NOMBRE
DEL REACTIVO
|
CONCENTRACIÓN
|
CANTIDAD
|
1
|
Oxalato de amonio
|
1%
|
1 ml
|
3.2 Equipo de Laboratorio
1.1.1 Centrífuga
1.1.2 Agitador eléctrico
1.1.3 Microscopio de luz
3.3 Materiales de Laboratorio
NÚMERO
|
DESCRIPCIÓN
|
2
|
Tubos de recogida de muestras con
EDTA
|
1
|
Aguja de Vacutainer
|
1
|
Contenedor de Vacutainer
|
1
|
Jeringa
|
1
|
Torundas de algodón con alcohol isopropílico
|
1
|
Ligadura
|
1
|
Cámara de Neubauer
|
1
|
Pipeta de Thoma
|
1
|
Boquilla y manguera para aspiración
|
4.PROCEDIMIENTO.
4.1
Técnica
4.1.1 Si
se obtiene la muestra por punción digital, el sitio debe estar limpio y la
sangre debe fluir libremente. Limpia la primera gota. Si la muestra es de
sangre venosa debe obtenerse con una jeringa de plástico seca ( ó de vidrio
siliconizado ) con aguja corta, de calibre no menor al 21.Retirar la aguja antes de poner la
sangre en un tubo de plástico con EDTA. La sangre y el anticoagulante deben
mezclarse inmediata y cuidadosamente,
para evitar la formación de espuma.
4.1.2
El
mezclado de la sangre con anticoagulante debe realizarse suavemente y durante
unos cinco minutos.
4.1.3
Con
la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca de 1.0 y se diluye hasta la
marca de 101 con el oxalato de amonio ( dil.1:100).Hacer por duplicado.
4.1.4
Colocar
las pipetas en el agitador de 10 a 15 minutos.
4.1.5
Llenar
la cámara de Neubauer con el contenido de las pipetas debidamente mezclado,
desechando las primeras 4-6 gotas.
4.1.6
Cubrir
la cámara con una caja de Petri de 10 a
20 min, para permitir que las plaquetas se sedimenten. Colocar un pedazo de
algodón ó de papel filtro mojados dentro de la caja para evitar la evaporación.
4.1.7
Empleando
el microscopio de contraste de fases, contar las plaquetas en la cuadrícula
central destinada a la cuenta de glóbulos rojos ( 25 cuadros centrales )calculando la cifra de plaquetas
como sigue:
No.
De plaquetas /μl= No
de plaquetas contadas X factor de dilución( 100) X factor de corrección de volumen ( 10)= No
de plaquetas contadas X 1000.
4.1 Factores
de Error en las Cuentas Celulares.
4.2.1
Cuando se use sangre capilar se requiera una gota que fluya libremente.
4.1.2
Las muestras de sangre anticoagulada se deben
mezclar cuidadosamente invirtiendo el
tubo de sangre por lo menos 20 veces. No se debe agitar el tubo pues se forma
espuma que impide medir cantidades exactas. Inclinar el tubo bien mezclado a un
ángulo de 45°, ó ligeramente mayor, y pipetear del borde superior del tubo
siguiendo las mismas indicaciones que para sangre capilar.
4.1.3
Las
pipetas deben estar limpias y secas.
4.1.4
Tomar
las muestras con la pipeta en forma
rápida y precisa. Si se rebasa la línea del volumen deseado ligeramente,
ajustar tocando un papel absorbente con la punta de la pipeta,
4.1.5
Limpiar el exterior de la pipeta antes de
introducirla en la solución disolvente.
4.1.6
La
cámara se llena por acción capilar, regulando
el flujo del líquido de la pipeta,
para que fluya suave y rápidamente, Llenar la cámara completamente, sin permitir que el
líquido rebase los límites. Esperar de 10 a 20 minutos a que las células se
asienten en el área de conteo. Proseguir con el conteo.
4.1.7
La
cámara del hemocitómetro y el cubreobjetos deben estar limpios y secos antes de usarse. Esto evita errores graves
que se producen por las huellas
digitales y las superficies aceitosas.
ACTIVIDADES.
1. Reportar resultados.
“TIEMPO
DE COAGULACIÓN “
1.
INTRODUCCIÓN.
El tiempo de coagulación es un estudio
creado en 1939. Nos da un indicio aproximado de la eficacia global del
mecanismo intrínseco de la coagulación.
La prueba carece de valor para las
insuficiencias ligeras de distintos factores, porque basta con una pequeña
cantidad de trombina para producir un
coágulo fibrina. Todavía es menos útil para las anomalías de las últimas etapas
de la coagulación.
2. PRINCIPIO
Y METODOLOGÍA
El tiempo de coagulación mide el intervalo de tiempo
necesario para que una muestra de sangre completa recién obtenida coagule in vitro a 37°C y
evalúe en forma general el mecanismo de
coagulación intrínseco.
Dos son las finalidades más relevantes
de este método:
1. Evaluar la función del sistema
intrínseco de la coagulación sanguínea.
2. Vigilar la eficiencia de la
administración de heparina.
3
.LISTA DE REQUERIMIENTOS.
3.1Equipo
de laboratorio.
3.1.1Baño María a 37°C
3.1.2Cronómetro
3.2Material de Laboratorio.
CANTIDAD
|
DESCRIPCIÓN
|
3
|
Tubos
de vidrio de 12X75
|
1
|
gradilla
|
4. PROCEDIMIENTO.
4.1 Método de Lee-White
1. Se
extrae sangre venosa con una jeringa de 5 ml, y una aguja gruesa ( del
No.18 ó 19 ). La punción venosa debe ser perfecta, pues la contaminación con
linfa puede modificar los resultados.
2. Preparar el baño María a 37°C, colocando una
gradilla dentro de él, con 3 tubos de 12 X 75.
3. Se le realiza al paciente una punción
de 3 ml poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que entra la sangre a
la jeringa.
4. Terminada la punción, se deposita 1ml
de sangre en cada tuboy se vigilan cada 30 seg., inclinándolos suavemente y
anotando el tiempo en que coagula cada uno de ellos.
5. Se suman los tres tiempos, y se
calcula el promedio, obteniendo así el resultado.
6. Durante el proceso, evitar la
agitación, que podría retardar el tiempo de coagulación.
4.2 Valores de Referencia: 4-10 minutos.
"TIEMPO DE SANGRADO"
1.INTRODUCCIÓN.
El tiempo de sangrado es una medida de
Integridad vascular y plaquetaria. Las plaquetas se adhieren a la colágena
expuesta ( subendotelial) y después entre ellas, para formar un agregado que
obtura la herida. Para la agregación plaquetaria, también es necesario un
factor del plasma: el factor de Von Willebrand.
2.PRINCIPIO
Y METODOLOGÍA
El tiempo de sangrado se mide
determinando el tiempo necesario para que dejen de sangrar los pequeños vasos
subcutáneos que han sido lesionados por una Incisión estandarizada. Uno de los
mayores problemas que confronta la medición del tiempo de sangrado es la
reproducibilidad. Por esta razón se han desarrollado tres generaciones de
pruebas, cada una con aumento en la estandarización de la herida en profundidad
y longitud.
El método más antiguo es el de Duke,
que consiste en hacer una punción del lóbulo de la oreja con una lanceta
estéril. La desventaja de este método es que es muy difícil estandarizar la
profundidad de la incisión. Además, si el paciente tiene un serio problema
hemorrágico, el sangrado en el tejido celular blando del lóbulo de la oreja
puede causar un hematoma grande.
El método de Ivy está mejor
estandarizado que el de Duke. Se utiliza una lanceta ó estilete para producir
una incisión en la cara anterior del antebrazo. La navaja tiene un tope que
"mita la profundidad de la Incisión. Además, como la cara anterior del
antebrazo es suficientemente larga para permitir varias incisiones, pueden
hacerse dos ó tres de ellas y promediar sus resultados. Adicionalmente, en este
método está mejor estandarizada la presión del sistema vascular, ya que un
esfingomanómetro que se coloca en el brazo (40 mmHg), mantiene la presión
venosa dentro de límites reducidos.
3.LISTA
DE REQUERIMIENTOS
3.1Material de Laboratorio
CANTIDAD
|
DESCRIPCIÓN
|
1
|
Lancetas desechables estériles
|
1
|
Tiras de papel filtro
|
1
|
Torundas de algodón con alcohol
|
4.
PROCEDIMIENTO
4.1
Técnica: Método de Duke.
1. Limpiar
perfectamente el lóbulo de la oreja o la yema de un dedo con una torunda con
alcohol. Dejar secar .
2. Puncionar
el sitio elegido con la lanceta, echando a andar al mismo tiempo, el
cronómetro. La punción debe hacerse en un solo movimiento, introduciendo la
lanceta hasta el fondo y sin hacer movimientos laterales de ésta para no rasgar
la piel o hacer más amplia la punción.
3. Sin
tocar la piel, con una t'ra de papel filtro, secar la gota de sangre que salga
por el sitio de pund6n cada 30 segundos, hasta que ea papel flltro ya no
absorba sangre.
4. Anotar
el tiempo en que deje de sangrar .
Ventajas: es muy sencillo de realizar
.
Desventajas: Las condiciones de la
prueba no son constantes, por lo tanto los resultados son imprecisos.
4.3
Valores de Referencia.
Método de Duke: 1 a 4 minutos
Método de Ivy: de 2 a 6 minutos
"MEDICIÓN DEL SISTEMA EXTRÍNSECO
TIEMPO DE PROTROMBINA ( TP ) EN UNA ETAPA"
1.
INTRODUCCIÓN.
El análisis de tiempo de Protrombina
es sensible a las deficiencias del sistema extrínseco de la coagulación (
factores I, II, V, VII ó X ). El TP se utiliza como exploraci6n prequirúrgica
para detectar posibles problemas hemorrágicos. Un TP prolongado Generalmente es
indicativo de un nivel bajo en uno o más de los factores del sistema de
coagulación extrínseco ó común, cuya causa pueden ser trastornos hereditarios
de la coagulación, una deficiencia de vitamina K, problemas hepáticos ó
ingestión de fármacos. El TP es el análisis de laboratorio más corriente
empleado para monitorizar la terapia anticoagulante oral, puesto que es
sensible a los factores VII y X.
No es sensible a las deficiencias del
sistema intrínseco ( factores VIII. IX. XI y XII ) ó a las disfunciones
plaquetarias. No puede utilizarse para la monitorización de la terapia de
heparina, para la cual está recomendada la determinación del Tiempo de
activación Parcial de Tromboplastina ( ATTP)
2.
PRINCIPIO Y METODOLOGÍA
El TP es el tiempo requerido para que
se coagule el plasma después de agregarle tromboplastina tisular v una cantidad
óptima de cloruro de calcio, reponiendo
el calcio que fue inactivado con el
anticoagulante y agregando una tromboplastina completa para activar la vía
extrínseca. El método de referencia de la Prueba del TP en una etapa es el
recomendado por el Consejo Internacional de Estandarización en
Hematología/Consejo Internacional de Trombosis y Hemostasia (CIEH/CITH).
Los resultados obtenidos dependen de
numerosos factores como la temperatura, la calidad del agua, el pH, la fuerza
iónica, el método de ensayo utilizado, la recogida y conservación de las
muestras, y la población de pacientes en consideración. Los rangos normales de
muestras deben ser establecidos para cada laboratorio.
Para
cada nuevo lote de tromboplastina ( preparada en el laboratorio ó comercial ),
se deben establecer valores normales en muestras de plasma, de aproximadamente
20 hombres ó mujeres que no estén tomando anticonceptivos. Para ello, no es
necesario que todas las pruebas se efectúen el mismo día. Es preferible
hacerlas en días distintos pues así se consigue agregar la variabilidad de día
a día. La media y la desviación estándar se calculan a partir de los
resultados.
El resultado de la prueba en segundos
se convierte a Porcentaje de Actividad normal por medio de una curva de
referencia.
El Índice de tiempo de Protrombina se
calcula dividiendo el TP por el TP medio Del rango normal del laboratorio,
representado por una muestra testigo normal.
Para
emplearse en el control de la medicación anticoagulante, el Índice de
Protrombina debe designarse en los informes de laboratorio de manera estándar
como Tasa Normalizada Internacional de Protrombina ó INR del inglés
International Normalizad Ratio.
SE SUGIERE PUES, REPORTAR DE LA
SIGUIENTE MANERA:
TIEMPO DE PROTROMBINA:
Testigo del dia ……………………………………..X
segundos
Plasma Problema …………………………….... …X
segundos
Porcentaje de actividad ……………………… ……….%
INR
………………………………………………………X
3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.
3.1 Reactivos
NUM
|
NOMBRE
DEL REACTIVO
|
CONC
|
CANTIDAD
|
1
|
Reactivo
de Tromboplastina.*
|
|
200μl
|
2
|
Diluyente**
|
|
10 ml
|
3
|
Anticoagulante
Citrato de sodio
|
3.2 a3.8%
|
1gota/ml de sangre
|
*Reactivo de Tromboplastina:
Tromboplastina tisular procedente de cerebro de
conejo,
iones de Caldo V estabilizador .
**Diluyente. Estabilizadores y
Conservantes. Contiene azida sódica al 0.05% como conservante.
3.2 Equipo
de Laboratorio
- Baño
María con termostato a 37º C
- Cronometro.
3.3
Material de Laboratorio
CANTIDAD
|
DESCRIPCIÓN
|
1
|
Micropipeta con punta desechable
|
1
|
Tubos de recogida al vacío con
citrato de sodio al 3.2% ó 3.8%.
|
1
|
Gradilla.
|
3
|
Tubos
de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla.
|
1
|
Gancho
de alambre metálico,
|
4.PROCEDIMIENTO
4.1Técnica:
4.1.1
Calentar previamente un volumen
suficiente del reactivo de tromboplastina reconstituido a 37ºC .Tomar las
precauciones necesarias para Impedir la evaporación y no mantener a 37ºC sin
tapón durante más de 60 minutos antes del uso.
4.1.2. Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra ( paciente y control)
del análisis.
4.1.3. Agregar
0.1 ml de muestra al tubo apropiado.
4.1.4 Incubar
cada muestra y control a 37ºC de 3 a 10 min.
4.1.5 Con
fuerza, agregar 0.2 ml del reactivo de tromboplastina precalentado, y al mismo
tiempo, iniciar el cronometraje de detección de coagulación.
4.1.6 Anotar
el tiempo en segundos requerido para detectar la coagulación.
4.2 Preparación
de la Muestra y del Reactivo.
4.2.1Muestra: No es necesario que el paciente esté
en ayunas ni se someta a otra preparación especial. Se recomienda plasma con
anticoagulante de citrato de sodio al 3.2% en una proporción de nueve partes de
sangre por una de anticoagulante.
4.2.2 Reactivo: El reactivo se prepara de la siguiente
manera:
Reconstituir un vial de reactivo de
tromboplastina con un vial de diluyente. Los dos componentes deben ser del
mismo lote del kit. Volver a tapar el vial e invertirlo suavemente varias veces
para garantizar una rehidratación completa. Dejar reposar durante 30 min. A
temperatura ambiente. Invertir suavemente antes de su uso para garantizar
homogeneidad .El reactivo permanece estable durante cuatro días si se mantiene
en el vial original, tapado herméticamente y se almacena a 2-8ºC, y registrar la
fecha de la reconstitución en la etiqueta del vial.
"MEDICIÓN DEL SISTEMA INTRÍNSECO
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA ( TTPa )"
1.
INTRODUCCIÓN
Esta prueba mide la actividad
procoagulante intrínseca del plasma. Esta prueba es sensible a todos los
factores que intervienen en el sistema intrínseco, y no mide la actividad de
los factores VIl y XIII.
2. PRINCIPIO
Y METODOLOGÍA.
2.1 Principio.
La tromboplastina parcial es un
sustituto del factor plaquetario 3 ( fosfolípidos de cerebro de conejo). La
activación por contacto se estandariza añadiendo un activador como caolín,
celita ó ácido elágico al reactivo.
1.2 Metodología:
Preparación de las Muestras.
En un tubo limpio, conteniendo una
parte de sol. Anticoagulante , añadir 9 partes de sangre recién obtenida.
Mezclar con suavidad. Conservar el tubo en refrigerador ó en hielo picado.
Antes de realizar la prueba, centrifugar y separar el plasma. Las pruebas deben
complementarse dentro de las 4 horas siguientes a la obtención de la muestra.
3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.
3.1 Reactivos
NUM
|
NOMBRE
DEL REACTIVO
|
CONC
|
CANTIDAD
|
1
|
Reactivo
de Tromboplastina Parcial*
|
|
200μl
|
2
|
Cloruro
de calcio
|
0.025 M
|
10 ml
|
*Fosfolípidos
de cerebro de conejo adicionado de partículas de sílice micronizada que actúan
como activador ( superficie de contacto) y tampón ácido.
3.2 Equipo
de Laboratorio
- Baño
María con termostato a 37º C
- Cronometro.
3.3
Material de Laboratorio
CANTIDAD
|
DESCRIPCIÓN
|
1
|
Micropipeta con punta desechable
|
1
|
Tubos de recogida al vacío con
citrato de sodio al 3.2% ó 3.8%.
|
1
|
Gradilla.
|
3
|
Tubos
de ensayo de 12 X 75
|
1
|
Gancho
de alambre metálico,
|
2.
PROCEDIMIENTO
3.1TÉCNICA. ( método manual) .
3.1.1. Calentar
previamente a 37°C un volumen suficiente de solución de cloruro de Calcio
0.025M.
3.1.2. Identificar
un tubo de ensayo para cada muestra a analizar ( pacientes y controles). Se
aconseja hacer las pruebas por duplicado.
3.1.3 Dispensar
0.1 ml de plasma a su tubo correspondiente. Añadir 0.1 ml del reactivo de
tromboplastina parcial a cada tubo.
3.1.4. Incubar
a 37°C durante 5 minutos exactos ( tiempo de activación).
3.1.5. Inmediatamente
añadir 0.1 ml de solución de Ca 0.025M. Simultáneamente poner el cronómetro en
marcha y determinar la formación del coágulo.
3.1.6. Anotar
el tiempo en segundos, transcurridos hasta la formación del coágulo.
“RETRACCION
DEL COÁGULO “
1.
INTRODUCCIÓN.
La observación del coágulo formado en
un tubo de ensayo proporciona información sobre:
a)La concentración del fibrinógeno,b) el
número y función de las plaquetas y c) la actividad del sistema fibrinolítico.
2.
PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.
2.1 Aproximadamente el 30% del volumen total
de sangre en el tubo debe coagularse
2.2 En casos de trombocitopenia ó de
disfunción plaquetaria muy anormal, como
en la trombastenia, se forma un coágulo grande de estructura débil. Asimismo,
en casos de paraproteinemia ( mieloma ó macroglobulinemia de Waldenstrom), la
retracción del coágulo puede estar muy trastornada.
2.3 Un coágulo pequeño de forma regular
ocurre cuando la concentración del
fibrinógeno es baja.
2.4 Un coágulo pequeño de forma irregular
se observa cuando el incremento en la actividad fibrinolítica lo digiere, como
ocurre en la coagulación intravascular diseminada ( CID ).
2.5 No se observa formación de coágulo
alguno.
2.6 Causas de error
Tubos de ensayo sucios
Contaminación de
sangre con anticoagulante
1.
LISTA DE REQUERIMIENTOS.
3.1Equipo de Laboratorio.
Baño María a 37°C
3.2Material de Laboratorio
CANTIDAD
|
DESCRIPCIÓN
|
2
|
Tubos
de vidrio de 13 X 100 de fondo redondo
|
1
|
Gancho
de alambre
|
1
|
Aplicador
de madera
|
1
|
Caja
Petri con papel filtro dentro de ella
|
1
|
Jeringa
de 5 ml ó Sistema Vacutainer
|
1
|
Ligadura
|
1
|
Torunda
con alcohol isopropílico
|
2. PROCEDIMIENTO
1.1
Tomar
una muestra de sangre y depositar la muestra en un tubo de vidrio de 13 X 100
1.2
Colocar el tubo con la muestra de sangre en el baño
María a 37°C durante 3 horas.
1.3
Observar
después de transcurrido este tiempo, la forma del coágulo, rodeado de suero
1.4
.Ayudarse
con el gancho de alambre para vaciar el
contenido del tubo lentamente a la caja de Petri con un papel filtro dentro de
ella.
1.5
Observar
y buscar un coágulo pequeño en caso de que en el tubo no se haya apreciado
un coágulo grande.
Bibliografía:
DESCHAMPS LAGO MARIA ESTHER. Manual de Practicas de Laboratorio. Veracruz, México. 46 páginas.
En
la mayoría de los instrumentos de aféresis se utiliza la fuerza centrífuga como
método de separación, la cual se basa en la diferencias de densidad entre cada
componente.
